Amplificación del ADN, y resultados de las actividades PGPRs y nodulación de plantas

Esta entrada corresponde a la quinta sesión del proyecto de investigación PIIISA “Biofertilizantes con sabor a aceite de oliva: aislamiento de bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) de composts de “alperujo”.

El proyecto ya se va acabando y hemos hecho muchas cosas que detallamos a continuación:

1) Amplificación del ADN de los aislados bacterianos.

Lo hecho hasta ahora: Si recordamos, del compost aislamos bacterias que crecían en un medio sin nitrógeno (medio BURK) lo que significa que crecen transformando el nitrógeno atmosférico (fijación de nitrógeno). Las miramos al microscopio, las seleccionamos según su morfología e hicimos una placa “master” para obtener las cepas de forma individual. Luego las crecimos en tubos de ensayo para después centrifugar el cultivo y extraer su ADN usando un kit comercial. Para más información, releer las entradas anteriores.

Lo que hemos hecho hoy: Con ese ADN hemos amplificado la parte correspondiente al gen 16S rRNA, que es un indicador filogenético que nos sirve para identificar a las bacterias (es como si fuese su DNI). Vamos a hacer muchas copias (amplificar) de un fragmento muy pequeño del ADN total de las bacterias (un gen) y luego lo vamos a secuenciar (vamos a saber los nucleótidos que lo componen). Finalmente, usaremos las bases de datos disponibles para identificar a esas bacterias.

El procedimiento ha sido el siguiente:

Hemos usado una PCR o reacción en cadena de la polimerasa, la enzima que es capaz de copiar el ADN. Para eso, hemos hecho una mezcla de varios componentes para la reacción (“master mix”) que llevaba nuestro ADN, agua calidad MQ, cebadores o nucleótidos, sales para favorecer la reacción y la enzima polimerasa. Para saber más sobre esta técnica, os recomiendo el siguiente vídeo:

 

Después, para comprobar que hemos amplificado bien hemos hecho una electroforesis de gel de agarosa que nos permite identificar el tamaño molecular del ADN que hemos amplificado con respecto a un ADN patrón de tamaño conocido.

Electroforesis de agarosaElectroforesis de agarosa

Electroforesis de agarosa
Foto cortesía de Antonio Quesada Ramos

Este es el resultado:

Gel de agarosa

Como no ha dado tiempo, el producto que hemos amplificado nosotros (Antonio y yo) lo hemos limpiado y mandado a secuenciar al servicio de secuenciación de la EEZ. Los resultados los veremos en la próxima sesión.

2) Resultados de las actividades PGPRs: producción de sideróforos y solubilización de fosfato

 

Lo hecho hasta ahora: Si recordamos, los aislados obtenidos los pusimos a crecer en placas petri con dos medios específicos que nos permitían saber si producen sideróforos o puedes solubilizar fosfato. El primero es un medio azul y si forma halo naranja, es que produce los sideróforos (o compuestos que reaccionan con el hierro del suelo solubilizandolo). El segundo forma un halo blanco que es indicador que solubiliza fósforo insoluble.

Lo que hemos hecho hoy. Pues bien, después de varias semanas de crecimiento estos son los resultados:

PGPRs
Foto cortesía de Antonio Quesada Ramos
PGPR50
Foto cortesía de Antonio Quesada Ramos

Veamos el diámetro del halo para cada una de las cepas:

PGPRs

PGPRs

Datos PGPR

Conclusión: las cepas 1, 2, 7 y 9 son las que tienen estas dos propiedades PGPRs. Por eso, nos vamos a centrar en estas cuatro cepas para identificarlas.

3) Resultados de nodulación con plantas leguminosas: soja, judía y garbanzo

Lo que hemos hecho: Ya pusimos un experimento de plantas donde las inoculamos con el compost sólido y no vimos resultados positivos (no había nódulos). Para confirmar este resultado, volvimos a repetir el experimento pero esta vez inoculando las plantas con un extracto acuoso del compost. Las plantas están crecidas en condiciones controladas de luz y temperatura y las hemos regado con una disolución nutritiva sin nitrógeno. Si las plantas crecen bien, será por que habrá nódulos con bacterias que fijan nitrógeno.

Lo que hemos hecho hoy: Hemos ido a la cámara de cultivo donde están las plantas para sacarlas y ver si tenían nódulos. El aspecto que tenían no era muy bueno, estaban amarillas (indicador que no han crecido con nitrógeno).

Nodulos100
Foto cortesía de Antonio Quesada Ramos
Nodulos400
Foto cortesía de Antonio Quesada Ramos
Nodulos-300
Foto cortesía de Antonio Quesada Ramos
Nódulos500
Foto cortesía de Antonio Quesada Ramos

Muchas de ellas no tenían nódulos, pero sorprendentemente algunas si las tenían (concretamente las judías). Es un resultado positivo, pero habría que confirmarlo porque el aspecto de las plantas no era el que debían tener.

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