Extracción.
La extracción es el primer paso para aislar y caracterizar las sustancias húmicas, debiéndose extraer en la forma menos inalterada posible y evitando la co-extracción de otro tipo de sustancias con características no húmicas tales como carbohidratos, grasas y aminoácidos, que interfieren su correcta caracterización (Ciavatta y col., 1988).
Los procedimientos de extracción constituyen la fase más crítica en el estudio de las sustancias húmicas, habiéndose esto estudiado intensamente desde hace más de dos siglos. El extractante ideal debería solubilizar estas sustancias sin producir cambios en su estructura molecular y propiedades (Schnitzer, 1978). Según Stevenson (1994), el método de extracción idóneo debe cumplir los siguientes objetivos:
·El método utilizado no debe alterar la materia orgánica aislada.
·Las sustancias húmicas obtenidas deben estar libres de impurezas inorgánicas como pueden ser arcillas y cationes polivalentes.
·La extracción se puede considerar completa si el peso molecular medio de la fracción obtenida es representativo de la muestra.
·El método debe ser universal para cualquier tipo de sustrato.
El gran número de condiciones ensayadas es la mejor demostración de que la extracción de sustancias húmicas es un problema aún no del todo resuelto. Según las características de cada material, hay que adaptar el método extractivo buscando un rendimiento máximo en la obtención de dichas sustancias, pero a la vez minimizando la posible interferencia de otros componentes.
Factores que influyen en la extracción.
Concentración y tipo de extractante.
Uno de los parámetros que influye de modo importante en la solubilidad de la materia orgánica de sustratos orgánicos es el tipo de extractante. De todos los extractantes empleados es el NaOH 0,1 M el que más se ha utilizado, ya que permite obtener altos rendimientos. Este extractante ha sido usado por numerosos investigadores tales como Giusquiani y col. (1994) para suelos, y también para composts procedentes de lodos de depuradora, purines de cerdo o residuos sólidos urbanos (RSU) (Chefetz y col., 1996; Bernal y col., 1998). El Na4P2O7 0,1 M se ha utilizado para la solubilización de sustancias húmicas, consiguiéndose generalmente menores rendimientos de extracción que con los extractantes alcalinos, tal y como comprobaron García y col. (1993a) trabajando con turba. Dicho extractante también ha sido empleado para solubilizar la materia orgánica de compost de RSU (García y col., 1992a y b), así como de distintos tipos de suelos (Fujitake y col., 1998). Otro extractante empleado con frecuencia es la mezcla NaOH-Na4P2O7 a concentración 0,1 M, que ha sido aplicada tanto sobre suelos (Tomar y col., 1992) como sobre turbas (Tonelli y col., 1997).
La apropiada concentración del extractante ha sido igualmente objeto de numerosos estudios, habiéndose utilizado más frecuentemente en el caso del NaOH la concentración 0,1 M (Miikki y col., 1997; Tomati y col., 2001), si bien algunos como Piccolo y Mirabella (1987) utilizaron la concentración 0,5 M, e incluso, hay quienes han experimentado la concentración 1 M, pero en este caso con KOH, como es el caso de Ouatmane (2000).
Relación de extracción.
Otro de los factores que puede afectar a la solubilidad de la materia orgánica es la relación de extracción (P/V), que relaciona el peso de sustrato y el volumen del agente extractante utilizado, ya que influye en la concentración de la materia orgánica líquida que puede obtenerse en el proceso de extracción. Mientras que para suelos la P/V recomendada por la Sociedad Internacional de Sustancias Húmicas (IHSS) es la 1/10 como relación de extracción aplicable al aislamiento de sustancias húmicas, para otros materiales puede ser necesario un aumento de la proporción de extractante, sobre todo, cuando pueda esperarse una elevada solubilización de materiales que sature la disolución, antes de que se extraiga toda la materia orgánica de que el disolvente es capaz. Por este motivo, Cegarra y col (1974) emplearon distintos valores de P/V utilizando como sustratos estiércoles, turbas y suelos calizos pobres en materia orgánica enmendados con estos materiales. En la obtención de sustancias húmicas de materiales muy ricos en materia orgánica tales como turbas, lignitos, estiércoles y composts, el valor de P/V generalmente más utilizado ha sido 1/20 (García y col., 1992a y b; Cegarra y col., 1994; Bernal y col., 1998; Caravaca y col., 2006).
Tiempo de extracción.
También, el tiempo utilizado en la extracción ha sido objeto de muchas investigaciones dependiendo del material orgánico. Cegarra (1978) estudió la influencia de este factor y observó que, a medida que aumentaba el tiempo de extracción desde 0,5 hasta 24 horas, también lo hacía el porcentaje de carbono extraído a partir de turba y un estiércol ovino. Sánchez-Monedero y col. (1996) utilizaron un tiempo de extracción de 4 horas sobre lignitos, estiércoles y composts de distinta procedencia, mientras que Francioso y col. (1998) emplearon 6 horas para turba y García y col. (1993b) 12 horas para lignito. Otros investigadores han utilizado un tiempo de 24 horas, tanto en materiales jóvenes como composts (Tomati y col., 2001) como también, en materiales altamente humificados tales como turbas y lignitos (Ayuso y col., 1997). Según el método recomendado por la IHSS para el aislamiento de sustancias húmicas, 4 horas es tiempo suficiente para solubilizar la mayor parte de la materia orgánica presente en suelos.
Temperatura de extracción.
En materiales ricos en materia orgánica como estiércoles, turbas, lignitos y composts, el rendimiento de extracción dependerá en gran medida de las condiciones en las que se trabaje, siendo la temperatura un factor relevante. De este modo, Cegarra y col. (1974) estudiaron el efecto de este parámetro sobre turba y estiércol ovino, con un intervalo de variación que osciló entre 30º y 80ºC. García y col. (1994) también analizaron el efecto de la temperatura sobre la extracción de sustancias húmicas de lignito empleando temperaturas de 20º, 50º y 80ºC, y Ouatmane (2000) estudió igualmente este efecto sobre la obtención de materia orgánica a partir de composts elaborados con serrín, estiércol animal y pulpa de café, utilizando temperaturas que oscilaron entre 25º y 80ºC. En general, todos estos estudios concluyeron demostrando que el incremento de temperatura durante la extracción, independientemente del sustrato y del extractante utilizado, incrementa el rendimiento de extracción.
Fraccionamiento.
El principal objetivo que se persigue cuando se fracciona los extractos de sustancias húmicas es reducir su heterogeneidad para facilitar la aplicación de las distintas técnicas analíticas y se basa en la separación de sus componentes aprovechando alguna propiedad relacionada con su composición molecular.
Se han empleado diferentes procedimientos para el fraccionamiento de las sustancias húmicas contenidas en la materia orgánica soluble, siendo el método más utilizado el que se basa en la variación del pH, dada la distinta solubilidad de tales sustancias según que el medio sea ácido o alcalino. De este modo, disminuyendo el valor de pH del extracto, generalmente obtenido en medio alcalino, hasta valores próximos a 2, se consigue la separación convencional en dos fracciones: AH y FF.
Sequi y col. (1986) introdujeron una modificación en la metodología convencional utilizada para fraccionar los materiales húmicos, cuyo objetivo era distinguir dos fracciones dentro de FF: la no humificada (NH) y los verdaderos ácidos fúlvicos (AF). Tal fraccionamiento se efectúa mediante el uso de un gel de resina de PVP empaquetado en columna, a través del cual se hace pasar la fracción FF, de manera que la componente NH atraviesa la columna, mientras que los AF quedan retenidos debido a sus características fenólicas.
Andersen y Sowers (1968) mostraron cómo la resina de PVP forma puentes de hidrógeno principalmente con grupos fenólicos, hidroxilo y carboxilo (Figura 1) y, posteriormente, otros investigadores (Lowe, 1975 y Watanabe y Kuwatsuka, 1992) comprobaron que tras hacer pasar la fracción FF a través de esta resina, la componente retenida o adsorbida (considerada como AF) está compuesta por compuestos polifenólicos y por sustancias caracterizadas por contener un gran número de anillos aromáticos y grupos carboxilo, mientras que la fracción no adsorbida (NH) está constituida principalmente por carbohidratos, péptidos, aminoazúcares, aminoácidos y otros compuestos de naturaleza no húmica.
En la Figura 2 se muestra un esquema actualizado de fraccionamiento de sustancias húmicas basado en la variación del pH y en el uso de PVP.
Otras técnicas de fraccionamiento también utilizadas se fundamentan en las diferencias en el tamaño molecular. Puede citarse al respecto la cromatografía de elución sobre gel, la ultrafiltración y la ultracentrifugación, siendo éstas dos últimas aplicables también tanto para la concentración como para la purificación de las sustancias húmicas. Basadas en la carga eléctrica de las moléculas, se han utilizado también la electroforesis de isoelectroenfoque y la isotacoforesis (De Nobili y col., 1999)
Purificación.
La purificación de las sustancias húmicas tiene como finalidad la eliminación de carbohidratos, proteínas, lípidos, compuestos orgánicos de bajo peso molecular y sales minerales, que son co-extraídas con las mismas, antes de proceder a su caracterización.
El uso de mezclas de ácidos minerales como HCl-HF ha sido propuesto por numerosos autores (Kumada, 1983; Kakezawa y col., 1992; Fujitake y col., 1998) con el fin de eliminar los componentes minerales de las sustancias húmicas extraídas tanto en suelos como en carbones fósiles y en composts. La efectividad del método se basa en la utilización del HF, debido a su capacidad para disolver minerales arcillosos hidratados y formar complejos con cationes di- y trivalentes. Según esta técnica, tanto compuestos orgánicos de bajo peso molecular como parte de las sales minerales son eliminados durante el proceso, con el inconveniente de que ni los metales fuertemente adsorbidos o complejados ni muchos hidróxidos pueden ser del todo separados.
Las impurezas de naturaleza orgánica (carbohidratos, proteínas, etc.) son el otro tipo de interferentes que pueden ser co-precipitados o co-adsorbidos junto con las sustancias húmicas. Estos compuestos podrían estar ligados covalentemente a la estructura de los AH, puesto que para su eliminación tienen que ser empleados métodos de separación bastante exhaustivos. La eliminación de lípidos como grasas, ceras, resinas, etc., se puede llevar a cabo con disolventes tales como el éter o mezclas alcohol-benceno. Se puede mejorar la eficacia del método usando la extracción de un gas supercrítico como el n-pentano (Schnitzer y col., 1986). También ha sido usada la ebullición de los AH en agua para la eliminación de polisacáridos, polipéptidos y pequeñas cantidades de ácidos fenólicos y aldehídos.
Los métodos de diálisis y electrodiálisis son bastante adecuados para purificar los AH, pero en cambio para la FF son poco eficaces, ya que al mismo tiempo que las sustancias impurificantes atraviesan las membranas, lo hacen también en gran medida muchos compuestos orgánicos de bajo peso molecular, característicos de los AF.
Una opción muy generalizada para la purificación de sustancias húmicas es someterlas a diálisis con una disolución de agua desionizada hasta que esté libre de iones cloruro, sodio y potasio, y seguido de una posterior liofilización (Ayuso y col., 1996; Trubetskaya y col., 2001).
