Extracción de ADN de bacterias y actividades promotoras del crecimiento vegetal (PGPRs)

Esta entrada corresponde a la cuarta sesión del proyecto de investigación PIIISA “Biofertilizantes con sabor a aceite de oliva: aislamiento de bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR) de composts de “alperujo”.

Retomamos nuestro proyecto de investigación PIIISA haciendo un breve resumen de lo que hemos hecho hasta el momento:

  1. Hemos aislado bacterias fijadoras de nitrógeno presentes en un compost mediante dos procedimientos:
    1. Vida libre: Hemos hecho una extracción acuosa del compost para inocular placas petri con medio BURK (específico de este tipo de bacterias). Los microorganismos fijadores de nitrógeno crecieron a 30ºC durante varias semanas. Después y con la ayuda de una lupa, hemos seleccionado algunas colonias con diferente morfología. Finalmente, hemos hecho una placa “master” (ver fotografía) que nos permite separarlas de forma independiente para tener cultivos puros de las mismas.ADN y PGPRs
    2. Simbiosis con leguminosas: Hemos cultivado en condiciones controladas varias plantas leguminosas (judía y soja) a las que hemos abonado con compost. Lo hemos hecho añadiendo directamente el compost al sustrato donde crecieron las semillas. El resultado obtenido hasta el momento es que no hay bacterias presentes en el compost que pueden formar nódulos en las raíces.ADN y PGPRs

En el día de hoy, avanzaremos en ambos procedimientos como veremos a continuación:

BACTERIAS FIJADORAS DE NITRÓGENO EN VIDA LIBRE

 

Con la placa “master” ya crecida, hemos pasado los diferentes aislados bacterianos a cultivos líquidos usando tubos de ensayo que se han incubado a 30ºC (lo hicimos Antonio y yo).

La finalidad es doble: (1) comprobar que crecen bien en el medio BURK para los experimentos de PGPR y (2) tener suficiente cantidad de cultivo bacteriano para extraer su ADN. Pero antes de seguir, algo de teoría:

ADN y PGPRs
Antonio nos explicó algunos conceptos básicos muy importantes para aclararnos los tipos de células que hay (procariota y eucariota), su estructura, y para que necesitamos la lisis celular para extraer el ADN. También nos enseñó los fundamentos de dos técnicas que nos permitirán conocer si las bacterias que hemos aislado tienen algunas propiedades que promueven el crecimiento vegetal (PGPRs) como la solubilización de fosfato insoluble o la producción de sideróforos (solubilización de hierro).

ADN y PGPRs ADN y PGPRs
PREGUNTA Nº1 PARA LOS ALUMNOS: ¿Por qué son importantes el fósforo y el hierro para las plantas? ¿por qué en algunos casos, las plantas no pueden asimilarlos aunque estén en grandes proporciones en los suelos agrícolas?

 

Propiedades PGPRs: solubilización de fosfato y producción de sideróforos.

 

Hemos añadido una gota (3 microlitros) de cultivo líquido de nuestros aislados en el centro de varias placas petri con dos medios específicos para el análisis de ambas propiedades. Si las bacterias crecen en estos medios, irán formando un halo blanco en el caso de la solubilización de fosfato y un halo naranja en la producción de sideróforos.

Sideróforos

Solubilización de fosfato

En solo varios días, ¡¡ya vemos sus propiedades PGPR!!

 

Extracción de ADN de los cultivos bacterianos

 

Vamos a trabajar con 9 cepas y para identificarlas, necesitamos aislar su ADN. Para eso, hemos utilizado un kit comercial, una forma fácil y sencilla de obtenerlo en un tiempo corto (un par de horas). La metodología se basa en concentrar el cultivo por centrifugación, lisar las células (es decir, disolver la membrana plasmática de la bacteria), eliminar los interferentes (proteínas y demás) y aislar el ADN.

¿Queréis hacerlo en casa?

Una vez terminado el proceso, ¿podemos ver las hebras de ADN?

Inoculación de plantas leguminosas con extractos de compost.

 

Como ya comentamos anteriormente, hicimos un experimento añadiendo composts a varias plantas de judía y soja con resultados negativos. Buscábamos ver que bacterias presentes en el compost pudieran formar nódulos en las raíces. ¿Qué aspecto tienen los nódulos? Este:

nódulos de soja

Para eliminar la duda, hemos vuelto a repetir el experimento variando la forma de inocular las semillas. Esta vez hemos hecho una extracción acuosa del compost y hemos inoculado las semillas con 1 ml del extracto. Además, hemos usado otra leguminosa, el garbanzo.

¿Qué os parece?, ¿creéis que hay nódulos?

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